Moleküler Tanıda HRM Yöntemi ve Önemi

---

08.04.16, Cuma

Her geçen gün yeni moleküler tanı yöntemleri ortaya çıkmaktadır. Ama bunların güvenilirliklerinin test edilmesi için araştırma amaçlı kullanmak ve değerlendirmek gerekmektedir.

Özellikle maaliyet düşük, pratik olması ve zaman kazancı gibi faktörlerin önemli olduğunu bilmekteyiz. Bu yüzden özellikle rutinde kullanım için reel çalışmalarla bu yöntemlerin konfirme edilmesi gerekmektedir.

Günümüzde birçok mutasyon tarama yöntemi bulunmaktadır. Bu yöntemler direkt (RFLP, ASA, Primer Uzaması ve DNA Dizi analizi gibi) ve indirekt yöntemler (SSCP, DHPLC ve Heterodupleks analizi gibi)  olarak tanımlanmıştır. Bu makalede bizimde kullandığımız Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi (High Resolution Melting-HRM) hakkında önemli bilgiler paylaşmayı hedefledik.

HRM yöntemi, Eş zamanlı (Real-time) PZR’ın kullanıma girmesiyle birlikte 1997’de geliştirilen bir yöntemdir (Lay ve Wittwer 1997; Ririe ve ark. 1997). High-resolution melting (HRM) analizi, sekans varyantlarının mutasyon taraması için güçlü ve kullanılabilir bir yöntemdir. Mutasyon taraması ve genotiplendirme başta olmak üzere asosiyasyon çalışmaları, genetik haritalama, aday gen taraması ve DNA metilasyon analizi gibi birçok çalışmada kullanılabilmektedir. Çift zincirli DNA erime sıcaklığı artmasıyla florasan değişiklikleri saptanabilir ve wild-tip (yabanıl) ile heterozigot örneklerin erime noktalarında kolaylıkla farklılaşmalar olabilir. HRM yöntemi yeni nesil mutasyon tarama teknolojilerine hizmet etmekte ve diğer görüntüleme methotlarıyla kıyaslandığında maliyeti düşük ve ekonomik açıdan önerilmektedir. HRM yöntemi bir kapalı tüp sistemidir. Bununla birlikte, HRM yöntemi moleküler tanı ve klinik amaçlı araştırmalar için hızlı mutasyon taraması sonuçları alabilmek için kullanılabilmektedir.

Bireysel ve popülasyonlar arasında genetik varyasyonları anlamak ve tanımlamak genomik sahasında önemli bir amaçtır. Bir bireyin tek genetik profili, bir hastalığa duyarlılığını veya özelliğini ortaya koymaktadır. Bu yüzden HRM yaşam bilimleri araştırmalarında görüntülemede kullanımı hızlı bir şekilde artmaktadır. Bir hastalığa duyarlı genin araştırılmasında ilk adım o genin ekzon ve intron bölgelerindeki mutasyonları görüntülemektir (Nguyen-Dumont ve ark. 2009). HRM yöntemi yeni nesil mutasyon tarama teknolojilerine hizmet etmekte ve diğer görüntüleme methotlarıyla kıyaslandığında maliyeti düşük ve ekonomik açıdan önerilmektedir. HRM yöntemi; metilasyon analizi, genotipleme, mevcut mutasyon görüntüleri ve küçük dizi farklılıklarına dayanan nükleik asit türlerini ayırmak için DNA erime eğrileri oluşturmaktadır (Nguyen-Dumont ve ark. 2009). HRM yönteminde veri eldesi ve analizi PZR’dan sonra 10-15 dk içinde gerçekleşmektedir. Veriler 2 sn’deki 0,1-1 derecedeki 1,0 derecelik sıcaklık artışına karşılık oluşan florasan şiddeti değişiminin ölçülmesi ile elde edilmektedir.         HRM yönteminin bir çok alanda kullanımı küçük amplikon genotiplemeyi, işaretsiz prob genotiplemede, metilasyon analizlerinde, snapback primer geneotiplemede, sekans karşılaştırmaları gibi alanlarda kullanımı mevcuttur (Erali ve Wittwer, 2010; Erali ve ark. 2008). Bununla birlikte, HRM yönteminin esas kullanım alanı gen taramasıdır.

Bizde 2014 yılında Marmara Üniversitesi Pendik Eğitim ve Araştırma Hastanesi’ne gelmiş olan 101 meme kanser hastalarda PIK3CA mutasyonlarını HRM yöntemiyle analiz etme imkanı bulduk. Elde ettiğimiz verilere göre, 101 hastanın 31’inde bu gende mutasyon saptanmıştır. HRM sonuçlarını Sanger dizilemeyle doğruladığımızda HRM’nin gücünün %87 gibi ciddi bir değere sahip olduğunu belirledik. Bu çalışmamızi saygın uluslararası bir dergide (SCI) yayınlatmayı başardık. Bu yüzden HRM yöntemiyle ilgili sadece mutasyon analizleri değil epigenetik mekanizmalar hakkında da çalışmaların sayısı arttıkça bu yöntemin anlam ve önemi ortaya çıkacağına inanıyoruz. Ayırca bu yöntemin rutin kullanımına da ön ayak olacaktır.