Biomedya - Biyoteknoloji & Yaşam Bilimleri

Araştırmacılar CRISPR-Cas9’u hücrelerde,in vivo olarak mutasyon yaratmak veya onarmak, raportör genleri veya purifikasyon etiketlerini, knock out genleri ve daha fazlasını eklemek için kullanabilirler. Hastalık etiyolojisi, ilaç keşif modelleri oluşturmak, daha iyi bitkileri geliştirmek ve zararlıları yok etmek konularında çalışabilirler. Sadece bir başlangıç olarak; New York Times Magazindeki son dönem yayında isimsiz bir bilim adamı ‘‘[CRISPR] birçok deneyimi mümkün kılmıştır, bu bir şeker dükkanında durup sadece üç şey seçeceğini bilmek gibidir. Yani gerçekleştirebilseniz denemek isteyeceğiniz binlerce deney daha var, tabi yeterli vaktiniz varsa.” demiştir.

CRISPR-Cas9 genom düzenlemenin gücü basit olmasından gelir. Çinko parmak nükleazları (ZFNs) ve efektör nükleazları ya da  transkripsiyon aktivatörü (TALENs) gibi daha önceki teknolojiler benzer özellikler sundu fakat nispeten karmaşık ve kullanımı pahalıydı. Aynı zamanda kolayca çok örneğin çalışılması mümkün olmuyordu ve bu da araştırmacıların düzenlemeleri yalnızca tek tek yapabildikleri anlamına geliyordu.

CRISPR geniş çoklandırmayı sağlamakta ve hedef DNA’ya komplementer olan kısa rehber RNA (gRNA)’dan daha fazla bir şey gerektirmemektedir. Kullanıcıların yapması gereken hücrelere bu RNA’yı, artı DNA’yı asıl düzenleyen Cas9 nükleazı dağıtmaktır. Sonrasında  hücre gerisini halledecektir. Reaktifler zaten Millipore, Sigma,Thermo Fisher Scientific ve Addgene gibi şirketlerden yaygın olarak temin edilebilir.

Teknoloji teknik olarak basit olmasına rağmen bazı araştırmacılar için pratiksel olarak zorunlu değildir. Kimi laboratuvarlar tek bir hücreyi seçip klonlama konusunda eksiktir, ki tek hücrenin klonlanması değiştirilmiş hücre popülasyonundan hücrelerin seçilmesi ve çoğaltılması için anahtar adımdır. Gerekçeleri ne olursa olsun,bu laboratuvarlar da şanslıdır. Artık genom düzenleme servis sağlayıcıları bu durgunluğu ortadan kaldırmak için varlar.

Sunulan hizmetler

Genom düzenleme şirketleri çoklu servisleri öneriyor fakat genel olarak reaktifler ve düzenlenmiş hücreler olmak üzere iki katagoriye ayrıldıkları söyleniyor. Laboratuvarın genom düzenleme müdürü Xin Jiang,örnek olarak TALEN- ve CRISPR / Cas9 tabanlı düzenleme öneren Harvard Kök Hücre Enstitüsü (HSCI) iPS Çekirdek Tesisi’nin üç seviyede servis sunduğunu söylüyor. Birinci modül olan reaktif dizaynı laboratuvar müşterilerin amaçladıkları hedef dizilerini, tanımlamak ve uygun gRNA lar dizayn etmek için, ikinci modül bu reaktifleri hücrelerde bir  gen susturması(knockout) oluşturmak için ve modül 3 onları bir raportör geni insert etmek veya nokta mutasyonlarını onarmak veya yaratmak gibi değişimleri yürütmek için kullanılır. Jiang hücre hattına bağlı olarak geri dönüş süresinin  yaklaşık  altı ay olduğunu  ve maliyeti Harvard/HSCI fakültesi için $1,970 (Modül 1) ile $15,200 (Modül 3) arası veya dışardan olan araştırmacılar için $2,140/$19,100 arası olduğunu söylüyor. Yale üniversitesi tıp okulu içerisindeki  hESC/iPSC fakültesinde hücre düzenleme maliyeti Yale fakültesi için $6,500 veya dışardan olan araştırmacılar için $8,000’dır ve laboratuvar direktörü Caihong Qiu’ya göre iki ay kadar kısa bir sürede tamamlanabilir. Şef memur Sanj Kumar indüklenmiş pluripotent yapıdaki (iPS) kök hücrelerini düzenleyen, oluşturan ve farklılaştıran (Horizon Discovery iş birliği ile) bir şirket olan  Axol Bioscience’da, düzenleme servisinin  $10,000 ile $30,000 aralığında olduğunu ve minimum 10 hafta gerektirdiğini söylemiştir. Axol’ün tam hizmeti iPS hattını oluşturur, düzenler ve bazı alt hücre tiplerine farklılaştırır. Kumar bunun biyoloji ve QC ihtiyaçları sebebiyle biraz daha fazla zaman alabildiğini söylemiştir.

Tabiki bu zaman çizelgesi her hücre hattı ve farklı projeler için kolayca hesaplanabilir. MilliporeSigma’nın fonksiyonel genomik market bölüm müdürü Shawn Shafer bazı hücrelerin diğerlerinden daha hızlı büyüdüğünü ve bazılarının her kromozomun klasik iki kopyasından daha fazla içerdiğini söylemiştir. Bazı genetik materyallerin bir kolon-karsinom hattında 10 kopyası olduğuna işaret etmiştir. “Eğer belirli bir geni knock out etmek isterseniz, hedeflemenin sonraki aşamaları için 10 kopya knock out etmek zorunda olabilirsiniz’’ demiştir.

Aynı zamanda diğer servislerde uygulanabilir. Örneğin; Thermo Fisher Scientific şirketinin  Ar-Ge bölümünün kıdemli direktörü Jon Chesnut bir gRNA üretim kütüphanesi tarama servisi önermektedir. Chesnut şirketin her insan kinazını hedefleyen (kinome) lentiviral gRNA partikülleri ürettiğini , örneğin; klasik genlere hedef gRNAların üretilebileceğini ve taranacabileceğini söylemiştir. MilliporeSigma tarama uygulamaları için diagnostik standartlar olarak hizmet etmesi için düzenlenen hücrelerin önceden yapılmış formalin ile fikse parafine gömülü örnekleri gibi sadece gRNA ekleyerek kararlı bir şekilde Cas9 ifade eden hücre hatları oluşturabilir.

Bazı şirketler araştırmacıların tasarladığı Cas9 varyantlarına dayalı servisler bile önerirler. MilliporeSigma; tanımlanmış genomik lokuslardaki gen ekpresyonlarını kontrol etmek için kullanıllabilen bir reaktif olan p300 histon asetil transferaz ile katalitik olarak inaktif (ölü) olan Cas9’un füzyonlarını ifade eden hücreler üretebilir durumdadır.

Shafer’a göre bu hizmetin kullanıcıları yalnızca dCas9-p300 ekspresyonunun kendini yapılandırmasının nerede olacağını tam olarak tanımlamaları gerekmektedir. Shafer; insan hücrelerindeki AAVS1 lokusunuda içeren, ‘‘diğer gen ekspresyonları ile etkileşime girmeyen genomun güvenli sığınak bölgelerini tanımladık’’ demiştir. MilliporeSigma aynı zamanda ZFN teknolojisine dayalı genom düzenleme servislerini önermiştir.

Peki ya kalite ?

Eğer genom düzenleme çalışmalarında dış kaynaksanız, alacağınız çıktıların hangisi olacağını ve onların maruz kalacakları kalite kontrol denetlemelerini iyice sorguladığınızdan emin olun. Qiu, örneğin; Yale’in genom düzenleme servisinin sadece minimal bir kalite kontrol önerdiğini, onların istenilen değişikliklerin yapılmasını sağlamak için hedeflenmiş bölgeyi dizilediklerini söylemiştir. Fakat laboratuvar aynı zamanda potansiyel herhangi hedef dışı efektlerden oluşan problemleri minimize etmek için müşterilere bir yerine üç klon tedarik eder.

HSCI’da, düzenlenmiş hücreler hem düzenleme bölgeleri dizilenmiş hem de çok iyi bir şekilde bozulmadan kalmış hücre genomlarını sağlamak için karyotip analizleri yapılmış haldedirler. Ücret için araştırmacılar immüno-boyama ve qPCR yolu ile yapılan pluripotentlik testleri gibi ek servisler talep edebilirler.

Chesnut benzer şekilde, Thermo Fisher Scientific bütün exom dizilemesi, protein ifade analizi, hedef dışı bölgelerin dizilenmesi ve hatta hücre morfolojisi ve iyon akışı gibi deneyler bile ilgili hedef lokusun varsayılan QC’si tamamlayabilir demiştir. Genom düzenleme servisleri akademiden endüstiriye geniş yelpazede kullanılır.

Thermo Fisher Scientific’in Ar-Ge bölümünün direktörü olan Davip Piper; birçok müşteri bu deneyleri yapmak için para ve uzmanlığa sahip olabilir fakat yapmamayı seçerler demiştir. ‘’Bu herhangi bir şey gibidir. Arabanızı yıkamak kolaydır ama bunu yaparmısınız ? Bu yetenek setleri ve zaman kaynaklarının bir dengesidir’’ demiştir. Ayrıca gerçekten servis sağlayanlar müşterilerin bütçeleri ile neyin uyumlu olup neyin uyumlu olmadığını anlamak için çalışırlar. MilliporeSigma’da örneğin; geri dönüş zamanı 12 ile 24 hafta arası sürmekte, araştırmacılar şirketin hücreleri klonlamasını seçebilir($32,000+) ya da kendilerinin klonlaması gereken karışık bir hücre havuzu ($9,000’dan başlayan fiyatlarla)’nu kabul edebilirler. Böylece zamandan ve paradan tasarruf edebilirler.

Shafer bunun ağır bir fiyat etiketi olduğunu kabul etse de ne için ödeme yaptıysanız onu alıyorsunuz diye eklemektedir. Bütün bunlardan sonra bazı müşteriler zorlu bir düzenlemenin takibinde aylarca kafalarını duvara vurduktan hemen sonra şirkete gelirler. “Bu durumda $30,000 ve $40,000 aralığı çok pahalıdır” demiştir. “Fakat boşyere geçmiş bir yıla kıyaslandığında çok daha makul gelmeye başlamaktadır” diye eklemiştir.

Kaynak: http://www.biocompare.com/Editorial-Articles/182403-Genome-Editing-Services-Enlist-the-Power-of-CRISPR-Cas9/