Cansu Kabasakal
PCR'ın Hikayesi
Polimeraz zincir tepkimesini keşfinden ötürü 1993 yılında Michael Smith ile birlikte Nobel Kimya Ödülüne layık görülmüştür. Polimeraz Zincir Reaksiyonunun (PCR) bulunması ile modern moleküler biyoloji ve moleküler tıptaki gelişmeler yenilenmiştir. Moleküler fotokopiye benzeyen bu teknik, İnsan Genomu Projesinin tamamlanmasında ve OJ Simpson hakkındaki davanın yargılanma aşamasında olayların merkezinde yer almıştır . Yakın geçmişte moleküler tanı alanlarında ve Yeni Nesil Dizilimleme Teknolojisi platformlarında kullanılmasıyla PCR, genomik bilimin önemli basamağı olarak kendini geliştirmiştir.
Gelin şimdi 35 yıllık bir serüven olan genetik mühendisliği ve moleküler biyoloji alanlarında çıkan raporlara bakalım. O zamanlarda, laboratuvarlarda DNA’yı sentezlemek ve çoğaltmak için yeni bir yöntemin olduğu bilim çevrelerinde duyulan güçlü fısıltılardan biriydi. PCR'ın büyüleyici tarihini incelerken, geçmişte ve gelecekte moleküler tanı alanındaki gelişmelerin nasıl olacağını ve nasıl şekilleneceğini göreceğiz.
Bazıları sıcak sever
Biyolojik bilimler doğrudan yada dolaylı olarak anlayışımızı geliştirmek için ilerlemek yerine daha genellikle önceki keşiflere güveniyor. Böyle olunca da 20 yıldan daha fazla süredir PCR'ın, moleküler biyoloji alanındaki bilim insanlarına fonksiyonel parçalar hakkında bilgi vermesi kaçınılmazdır.
1970 yılında genleri yapay olarak sentezleyen ilk bilim insanı olan H. Gobind Khorana, çalışmaları ile genetik kodun deşifre edilmesinde büyük önem taşıdı. Böylelikle sentezlediği yapılar ile içerdikleri özgül kodun ışığında üretilen peptitleri karşılaştırarak kalıtsal kodun hangi sıra ile okunduğunu, kodun başlangıç ve bitiş noktalarının nasıl belirlendiğini buldu. H.Gobind Khorana, sentez yöntemleri ile kalıtım mekanizmasının aydınlığa kavuşturulmasında etkili olmuştur. Protein sentezinde genetik kod ve işlevlerinin yorumlanması hakkında yaptığı araştırmalardan ötürü Nobel ödülünü kazanmıştır.
DNA polimeraz’in Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) için önemli olduğunu ve daha öncesinde yapılan araştırmaların PCR'ın keşfi için gerekli olduğunu söylemek pek hata sayılmaz. 1956 yılında, Nobel ödüllü Arthur Kornberg ve arkadaşları tarafından Escherichia coli’de yer alan DNA polimeraz I (Pol I) enzimi keşfedilmiştir. Ve bu keşif DNA`nın kendini nasıl eşlediğinin anlaşılmasına yol açmıştır. Bununla birlikte laboratuvarlarda kullanılmak üzere yeteri kadar anlamlı sonuç verebilen stabil DNA polimerazın bir türünü keşfetmek biyologların bir 20 yılını daha alacaktı.
1976 yılında, Cincinnati Üniversitesinden bir grup araştırmacı kaplıca ya da hidrotermal bacalarda yaşayan termofilik bir bakteri olan Thermus aquaticus bakterisinden Taq polimeraz enzimini keşfetti. Taq polimeraz enzimi, PCR'da kullanılan, yüksek sıcaklıklara (94 °C) ve denatürasyon sıcaklıklarına dayanabilen bir enzimdir.
1983 yıllarında, Nobel ödüllü Kary Mullis, California’da Cetus Corporation’da oligonükleotit (kısa DNA parçaları) sentezi üzerinde çalışırken hücredeki DNA sentezinin laboratuvar şartlarında teknik olarak gerçekleşebileceğini gözlemler. Mullis, reaksiyonunda her adım da (erime, bağlanma ve sentez) sıcaklıkların özenle kontrol edilmesini ve buna ek olarak reaksiyonlarda DNA polimeraz kullanarak farklı sıcaklıklardaki üç olayın çevrimler halinde tekrarının yapılması gerektiğini bulur. İki yıl sonra Cetus ekibi, Amerikan İnsan Genetiği Derneğinin yıllık toplantısında çalışmalarını sundular. Aynı yıl yöntem ilk olarak Science dergisinde yayınlandı. Ancak yeni geliştirilmiş olan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) yöntemi hakkındaki bu makale yaklaşık olarak 15 dergi tarafından reddedildi ve 1987 ye kadar da dergilerde yayınlanmadı.
Bilim insanları tarafından yeni yöntemin yavaş bulunması üzerine Cetus araştırmacıları orjinal yöntemi geliştirdiler. 1986 yılında, bilim insanları yöntemde hataları azaltıp ısıya hassas olan DNA polimeraz yerine Taq polimeraz kullanıldı. Böylelikle bu enzimin uzun sıcaklık derecelerine oldukça dayanıklı olması ile tüm döngüler boyunca verimli şekilde DNA sentezi yapabiliyordu. Bir yıl sonra, ABD kökenli uluslararası bir şirket olan Perkin Elmer’de çalışan bilim insanları PCR'da ısıtma ve soğutma sağlayan makine parçaları düzenlemek için termal döngüyü icat ettiler.
Sonuçta; 1988 yılında “Thermus aquaticus” bakterisinden saflaştırılan, ısıya dayanıklı polimerazın (taq polimeraz) kullanımı ile birlikte PCR için otomatize termal siklüs cihazları geliştirilmeye başlanmıştır.
Moleküler İşçiler
PCR'ın sahneye ilk çıktığı yıllardan beri, yöntemde bir takım değişiklikler olmuştur. Örneğin, 1991 yılında, Taq polimeraz yerine hipertermofilik bakteri olan Pyrococcus furiosus (Pfu) tanıtıldı. Taq polimeraz aksine, Pfu eksonükleaz redaksiyon faaliyeti hatalarını düzeltmek için imkan verdiği görülür. 1995 yılında, PCR kullanıcıları için iki yeni gelişme tanıtıldı. İlk yenilik olarak polimerazin aktif hale getirilmesini sağlayan ilk 95 ° C kısmı eriyene kadar, polimeraz aktivitesini inhibe eden bir immünglobulinin kullanılmasıdır. Bu işlemin PCR'ın özgüllüğünü arttırmada etkili olmasına rağmen, işlem süresinde artış gözlenmiş ve çapraz kontaminasyon gerçekleştirdiğinide pek çok araştırmacı kanıtlamıştır.
İkinci yenilik ise, moleküler biyoloji alanı ve PCR kullanarak başka alanlarda devrim yapabilecek yöntemler tanıtılmasıdır. Floresan ışıma tekniklerinin de kullanıma girmesiyle kinetik revers transkriptaz-PCR (RT-PCR)’da bir devrim yaşanmaktadır. Bu gelişim sayesinde artık gen kopya ürünlerinin düzeylerini sayısal değerlere dönüştürerek ölçmek, devam eden PZR reaksiyonunu ekranda izleyerek ‘Real Time’ (eş zamanlı) olarak reaksiyonun gidişine müdahale etmek ve PCR döngülerinin sayısıyla oynayabilmek de mümkündür. Bir çok adlandırmayla anılan bu teknolojiye floresan okuma yapması nedeniyle yayınlarda Floresan Kantitatif RT-PCR, Kantitatif-kinetik PCR (qPCR) gibi çeşitli adlar altında rastlamak mümkündür. Son 20 yılda daha yüksek verim ve basit qPCR makineleri oluşturmak için birçok şirket AR-GE faaliyetleri için milyarca dolar harcama gerçekleştirdi. Birden fazla gene ait çalışmaları qPCR ile gerçekleştirdiğinizde dizilimleme maliyetinin ve hata oranlarının fazla olması gibi sorunlar Yeni Nesil Dizilimleme Teknolojisi ile düzeltilebilmesi ile birçok araştırmacı PCRmakineleri ve yöntemlerini modernize etmek zorunda kaldı.
Dijital PCR (dPCR); Nükleik asitlerin tayini, miktar ölçülmesi ve analizi için geliştirilmiş yeni bir tekniktir. 2006 yılı çerçevesi içinde çıkan ilk sistem ile doğrudan veya klonal olarak DNA, cDNA ya da RNA dahil olmak üzere nükleik asitleri amplifiye etmek için kullanılabilir. dPCR ve geleneksel PCR arasındaki en önemli fark, eski PCR’a göre daha kesin bir yöntem olmasıdır. Nükleik asitlerin miktar ölçümü için kullanılan yöntem hassasiyeti ve özgüllüğü arttırmaktadır. Geleneksel PCR'da tek numune başına bir reaksiyonu yürütmektedir. dPCR aynı zamanda, bir numune içinde tek bir reaksiyon yapar, ancak numune bölümleri bir çok kısıma ayrılır ve reaksiyon, her bir bölme içinde gerçekleştirilir. Bu ayırma daha güvenilir toplama ve nükleik asit miktarları hassas ölçümünü sağlar. Bu tür kopya sayısı varyantları ve nokta mutasyonları gibi bir yöntem gen sekanslarının varyasyonlarını çalışmak için yararlı olarak elde edilmiş ve rutin numunede klonal amplifikasyonu için kullanılan bir yöntem olmuştur.
PCR Geleceği: Daha İyi, Daha Hızlı, Daha Güçlü
Gelecek yıllarda laboratuvar ortamlarında bazı yenilikleri kullanmayarak PCR tekniğinin kalmasını düşünmek olanaksızdır. Özellikle hatasız PCR örnekleri ve aynı zamanda basit DNA parçalarını oluşturabilmek için yükseltme aracı olarak Yeni Nesil Dizilimleme Teknolojisi kullanılacaktır.
Gündemde olan "Helal Gıda" sertifikası gibi uygulamaların hayata geçmesi durumunda et ve et ürünlerinde tür tayini, katkı maddelerinde domuz DNA'sı aranması, allerjenlerin tespiti gibi
konularda Real Time PCR yöntemlerinin kullanılması gıda sektörü açısından önemli avantajlar sağlayacaktır.
Ne olursa olsun yeni gelişmeler ve bunların yaşam bilimleri alanına etkisi ile PCR teknolojisinin ilerlemesi sınırsız olacaktır.
Kaynaklar:
http://www.genengnews.com/insight-and-intelligence/pcr-has-a-history-of-amplifying-itsgame/77900611/
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1968/khorana-bio.html
http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.biochem.71.090501.150041
http://www.thd.org.tr/thdData/userfiles/file/mugeaydinsayitoglu.pdf
http://www.turkhijyen.org/jvi.aspx?pdir=turkhijyen&plng=tur&un=THDBD-48902